抗生素和耐藥菌的關(guān)系，可謂是“道高一尺、魔高一丈”。近年來(lái)戰況焦灼，細菌耐藥性已成為全球性的公共衛生問(wèn)題?？此茻o(wú)解的輪回戰，或將由一種新療法——噬菌體療法的介入進(jìn)行破局。
事實(shí)上，噬菌體療法并不能說(shuō)是一種新療法，它作為抗菌劑甚至比抗生素出現的更早，之所以沒(méi)有像抗生素一樣大規模發(fā)展運用開(kāi)來(lái)，是因為其作為抗菌劑，存在一些缺陷，包括過(guò)多未知的影響因素、操作難度大、抗菌譜太窄等問(wèn)題，而合成生物學(xué)的出現，為噬菌體療法帶來(lái)了更多的可能性。
(來(lái)源：Nucleic Acids Research)
近日，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院馬迎飛團隊在國際學(xué)術(shù)期刊《核酸研究》（Nucleic Acids Research，IF=19）上發(fā)表了題為“Genome-scale top-down strategy to generate viable genome-reduced phages”的文章。該工作報道了一種高通量制備底盤(pán)噬菌體的方法，在鑒定噬菌體非必需基因的同時(shí)，獲得底盤(pán)噬菌體，并得到比野生型噬菌體侵染能力更強的基因組簡(jiǎn)化噬菌體，在噬菌體治療和噬菌體合成生物學(xué)中具有巨大的潛在價(jià)值。馬迎飛研究員為該文章的通訊作者，其博士生袁盛建為文章第一作者。
該研究得到了科技部重點(diǎn)研發(fā)計劃、中科院先導 B、中科院定量工程生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室、廣東省合成基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室及深圳合成生物學(xué)創(chuàng )新研究院的資助。
▲ 圖丨馬迎飛（來(lái)源：受訪(fǎng)者提供）
馬迎飛于 2009 年獲得中國科學(xué)院北京微生物研究所博士學(xué)位，曾先后在美國加州大學(xué)圣迭戈分校和紐約大學(xué)醫學(xué)院從事人微生物組計劃（Human Microbiome Project, HMP）相關(guān)項目的主要研究。2015 年入職深圳先進(jìn)技術(shù)研究院。目前團隊主要開(kāi)展噬菌體的基礎和應用研究。
高通量制備底盤(pán)噬菌體
噬菌體是地球上多樣性最高和最豐富的生物體，也是合成生物學(xué)研究中重要的模式生物。底盤(pán)噬菌體通過(guò)刪除基因組上的冗余基因，可以擴大噬菌體顆粒的 DNA 包裝空間，搭載更多的功能基因，增強其在各種生物工程應用中的抗菌活性和潛力，同時(shí)增加對噬菌體的理解。
目前，如何高通量刪除噬菌體冗余基因對科研人員來(lái)說(shuō)仍然具有挑戰性。第一，如何高通量識別噬菌體的非必需基因？第二，怎樣篩選具有生長(cháng)優(yōu)勢的突變噬菌體？第三，如何在逐個(gè)刪除基因組不同區域這種費力且耗時(shí)的情況下，同時(shí)篩選能夠維持穩健生長(cháng)的突變噬菌體？
CRISPR 是細菌對抗噬菌體的防御系統，當噬菌體侵染的細菌含有人工設計的 CRISPR 系統時(shí)，就有一定概率可以刪除噬菌體的某個(gè)基因（突變株 1）。如果用突變株 1 侵染含有另一個(gè)人工設計的 CRISPR 系統宿主菌時(shí)，就有一定概率可以刪除噬菌體的另一個(gè)基因（突變株 2），這樣持續下去，就能得到一個(gè)底盤(pán)噬菌體。
▲圖丨噬菌體基因連續刪除示意圖（來(lái)源：受訪(fǎng)者提供）
基于此，馬迎飛團隊猜想，是否可以把所有的含有不同人工設計的 CRISPR 系統宿主菌混合在一起，讓噬菌體基因高通量刪除并通過(guò)優(yōu)勝劣汰篩選出侵染能力強的突變株？
團隊開(kāi)發(fā)了一種稱(chēng)為基于 CRISPR-Cas9 的迭代噬菌體基因組簡(jiǎn)化方法（CRISPR/Cas9-based iterative phage genome reduction, CiPGr）。針對所有目標基因，設計不同的 CRISPR 系統，并在 DNA 芯片上合成，制備出刪除噬菌體不同基因的 CRISPR 細菌文庫。在 CiPGr 過(guò)程中，用一群噬菌體侵染細菌文庫，使不同的噬菌體刪除不同的基因，形成噬菌體突變文庫。如果被刪除的基因對噬菌體擴增非必需，則突變噬菌體后代可以繼續侵染新的細菌。噬菌體突變文庫不斷轉接到新鮮培養的細菌文庫中，使得基因缺失在噬菌體基因組中不斷積累，而具有生長(cháng)優(yōu)勢的基因組簡(jiǎn)化噬菌體將在種群中占主導地位，最終被富集并有可能被分離純化出來(lái)。
▲圖丨實(shí)驗流程設計（來(lái)源：受訪(fǎng)者提供）
團隊使用 CiPGr 成功簡(jiǎn)化了四種不同的有尾噬菌體（T7、T4、seszw 和 selz）基因組，得到了它們的底盤(pán)噬菌體、非必需基因集以及比野生型侵染能力更強的基因組簡(jiǎn)化噬菌體。
對獲得的噬菌體突變文庫進(jìn)行二代基因組測序，團隊通過(guò)生物信息分析，即可操作簡(jiǎn)單、高效率的獲得到噬菌體的可刪除基因集?？蓜h除基因集中的基因數量在 4 個(gè)不同噬菌體中，占總基因數的 50% 左右。
團隊發(fā)現部分突變株的抑菌或殺菌能力比野生型強，并對這些突變株進(jìn)行分離與鑒定。之后，研究人員將獲得的噬菌體突變文庫與野生型宿主菌混合在一起進(jìn)行培養，證實(shí)了通過(guò)基因組簡(jiǎn)化可以獲得比野生型噬菌體裂解能力更強突變株。
團隊還觀(guān)察到基因缺失數量隨著(zhù)轉接次數的增加而在單克隆突變噬菌體基因組中不斷積累。由此發(fā)現，單克隆突變噬菌體基因組中，越早被刪除的基因，對噬菌體擴增就越不重要。即基因刪除順序與其在噬菌體擴增中的重要性順序相關(guān)。
總的來(lái)說(shuō)，該方法具有多角度的重要意義。第一，能夠推廣至其他野生型噬菌體，前提是需要在 CiPGr 的操作過(guò)程中獲得噬菌體基因組序列，但無(wú)需其他先驗的知識；第二，這些簡(jiǎn)化噬菌體能夠整合更多的基因元件以增強噬菌體的功能，在噬菌體治療中具有巨大的應用潛力；第三，噬菌體基因組中必需、非必要和準必需基因的鑒定對于噬菌體基因組的重新設計和噬菌體生物學(xué)的研究具有重大意義。
臨床應用尚未發(fā)現不良效果
目前發(fā)現的很多能夠殺死細菌的化合物以及一些抗生素，都對人體有不同程度的毒性。例如被譽(yù)為“最后一道防線(xiàn)”的抗生素多粘菌素，就對人體具有很強的腎毒性。
噬菌體發(fā)現以來(lái)，一直都有用噬菌體來(lái)治療細菌感染成功的例子。
2019 年 nature medicine 發(fā)表了一例用噬菌體治療超級細菌感染的案例。案例中，一個(gè) 15 歲少年在接受雙側肺移植時(shí)，感染了膿腫分枝桿菌，一種耐藥性超級細菌，幾乎無(wú)藥可醫時(shí)，醫生在父母的強烈要求下，開(kāi)展噬菌體治療，利用基因組工程和正向遺傳學(xué)的方法找到了三株噬菌體，成功擊退了患者體內的超級細菌。
目前，國內噬菌體治療依然處于臨床試驗階段，也已有不少成功案例。
繼 1958 年余?教授的噬菌體治療案例 60 年后，2018 年全國第 2 例噬菌體治療在上海市公共衛生臨床中心（復旦大學(xué)附屬中山醫院南院）成功。該病例通過(guò)噬菌體療法痊愈，結束了忍受多年的超級肺炎克雷伯菌尿路感染，是國內首例獲得倫理審批的噬菌體治療案例。
馬迎飛還跟生輝 SynBio 透露，“我們現在正在通過(guò)大規模的動(dòng)物試驗來(lái)驗證噬菌體療法的效果，試驗動(dòng)物包括小鼠、大鼠、猴子等非常有代表性的模式生物，目前從初步結果來(lái)看，無(wú)論是對機體安全性還是機體對噬菌體的代謝，均顯示它是非常安全的一種殺菌劑，沒(méi)有引起動(dòng)物很?chē)乐氐拿庖叻磻??！?br/>2020 年，馬迎飛團隊成功聯(lián)合深圳人民醫院開(kāi)展了深圳市第一例應用噬菌體治療耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌肺部感染的臨床試驗。目前為止，已經(jīng)有多個(gè)人體臨床應用的成功案例，經(jīng)過(guò)評估之后使用噬菌體療法進(jìn)行治療，最后成功地清除了病人肺部的耐藥菌感染。
噬菌體作為新的替抗產(chǎn)品，有著(zhù)巨大的市場(chǎng)需求。
“我們曾對一家三甲醫院進(jìn)行調研，結果顯示，醫院每年臨床上耐藥菌感染病人多達幾千例，由此可估計全國范圍內，新的替抗產(chǎn)品需求非常大，目前，往往到了耐藥菌無(wú)藥可醫時(shí)，才想到應用噬菌體療法，如果能夠早期介入，可能會(huì )更好地改善臨床上耐藥菌感染的情況?！?br/>當前噬菌體療法，除了在臨床上和養殖上的應用問(wèn)題外，未來(lái)還需要臨床使用標準和規范。
“目前無(wú)論是臨床藥物還是養殖飼料添加劑，均沒(méi)有明確的臨床或使用規范。希望將來(lái)我們對噬菌體進(jìn)行一些創(chuàng )新研究之后，進(jìn)一步推動(dòng)監管部門(mén)的突破，促使噬菌體藥物能夠實(shí)現大規模應用。我個(gè)人非?？春檬删w療法的市場(chǎng)價(jià)值?！瘪R迎飛說(shuō)道。
目前，國內外在一些前沿性的噬菌體的合成生物學(xué)研究中相對比較同步，在噬菌體療法臨床及養殖上使用方面，面臨著(zhù)同樣的一些問(wèn)題?！皣H上其實(shí)已經(jīng)有一些公司開(kāi)展噬菌體療法的應用，如美國噬菌體領(lǐng)域的 APT 公司，現在已經(jīng)到了臨床 I 期、II 期階段，我們屬于一種緊追的狀態(tài)，希望將來(lái)能夠超過(guò)至少趕上它們?！?br/>最后，馬迎飛也表示非?？春煤铣缮飳W(xué)未來(lái)的發(fā)展，“我們常說(shuō) 21 世紀是生物學(xué)的世紀，我覺(jué)得更準確一點(diǎn)地說(shuō)，應該是合成生物學(xué)的世紀。對于噬菌體的合成生物學(xué)研究，能夠讓我們對噬菌體重新進(jìn)行設計、合成，并賦予一些新的功能，讓噬菌體更強大。未來(lái)，合成生物學(xué)將對噬菌體療法應用起到巨大的推動(dòng)作用?！?/p>
參考鏈接：1.https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkac1168/6895194